暨茵冻干实验室可提供外泌体冻干药物配方开发服务，核心是通过保护剂筛选、缓冲体系优化、冻干工艺适配与质量控制，实现外泌体结构完整、活性保留与长期稳定，覆盖从处方设计到工艺放大的全流程定制化解决方案。

l生物活性：细胞摄取效率（变化率≤15%）、靶向递送效率（≥85%）、治疗活性保留率（≥85%）；

l安全性：无菌性、内毒素含量（<0.5 EU/mL）、无细胞碎片污染。

二、保护剂开发：维持外泌体结构与功能的关键

1. 保护剂的类型与作用机制

冻干保护剂通过多种机制保护外泌体免受冻干过程中的物理化学损伤：

l 糖类保护剂：海藻糖、甘露chun、蔗糖、木糖chun等通过形成玻璃态基质稳定外泌体膜结构，减少冰晶形成。海藻糖能与生物大分子的极性基团形成氢键，替代失去的水分子，维持干燥状态下的结构稳定；其高玻璃化转变温度和低吸湿性使其成为生物制品长期储存的理想选择。

l聚合物保护剂：泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等能形成三维网络包裹外泌体，增强外膜完整性；降低细胞膜微黏度，促进外泌体递送；提高冻干体系的玻璃化转变温度，允许更高的干燥温度和更短的冻干周期。

l 天然渗透调节剂：依克多因（1.5%浓度）可有效维持外泌体的结构完整性，其β-半乳糖苷酶活性保留率较传统PBS缓冲液提升40%，且能维持荧光标记外泌体的稳定能量转移效率。

l 抗氧化剂：维生suC、谷胱gan肽等能清除冻干过程中产生的自由基，减少蛋白质氧化。

2. 保护剂筛选与优化策略

保护剂筛选应遵循"低浓度、高效果、低毒性"原则，并考虑以下因素：

l 细胞类型特异性：不同来源的外泌体对冻干的耐受性存在显著差异。研究表明，来自RAW264.7、MDA-MB-231和HeLa细胞的外泌体数量在深低温保存后减少，而破裂的外泌体数量显著增加；而来自L929、3T3-L1和MDA-MB-435细胞的外泌体在浓度和形态方面没有明显变化。

l组合优化：单一保护剂效果有限，复合保护剂通过协同效应可显著提高保护效果。例如，海藻糖与甘露chun复配（比例1:2）时，外泌体存活率提升至90%以上；依克多因与海藻糖复配可维持外泌体形貌完整并保持分散度。

l毒性评估：保护剂的毒性阈值是筛选的重要标准。研究表明，高浓度（超过40% w/v）的深低温保护剂（CPA）如DMSO或二糖可能具有对哺乳动物细胞的毒性；海藻糖的使用具有低溶解度和膜通透性的限制，可能引起渗透性应激。

l批次稳定性：保护剂配方需确保批次间差异小。研究表明，通过优化保护剂配比（如木糖chun5%±0.2%，甘露chun5%±0.3%，甘an酸2.5%±0.1%），结合冻干工艺参数优化，可将外泌体批次间差异（CV值）从传统方法的28.4%降至12.7%。

3. 保护剂筛选实验设计

保护剂筛选应采用系统化的实验设计方法：

3.1 单因素筛选：分别测试不同浓度的海藻糖（1-5%）、甘露chun（5-10%）、蔗糖（5-10%）、依克多因（1-2%）等保护剂对冻干外泌体的影响。

3.2 多因素优化：采用响应面法或田口设计法，优化保护剂组合比例。例如，海藻糖与甘露chun复配（比例1:2至3:1）时，可显著提高外泌体冻干后活性保留率。

3.3 稳定性评估：通过加速试验（40℃/75%湿度，6个月）和长期稳定性试验（25℃/60%湿度，12个月）评估不同保护剂配方下外泌体的稳定性。

3.4 功能活性验证：通过细胞实验验证冻干后外泌体的功能活性，如抗炎、抗纤维化、促血管生成等。

4. 保护剂组合推荐

基于研究，推荐以下保护剂组合：

l基础组合：海藻糖（2%）+甘露chun（8%）+维生suC（0.2%）+PVP（2%）

l  依克多因增强组合：海藻糖（2%）+甘露chun（8%）+依克多因（1.5%）

l 胆固chun稳定组合：海藻糖（2%）+甘露chun（8%）+胆固chun（30%）

组合选择需考虑外泌体来源、应用场景及监管要求。例如，对于需要穿透血脑屏障的神经疾病治疗用外泌体，胆固chun稳定组合可能更优；而对于皮肤应用，依克多因增强组合可能更适合。

三、赋形剂开发：提升冻干制剂物理稳定性的关键

1. 赋形剂的功能与选择原则

赋形剂在外泌体冻干制剂中主要发挥以下功能：

l填充剂：提供冻干后的多孔结构，便于复溶;

l稳定剂：维持冻干过程中外泌体的物理稳定性;

l分散剂：防止冻干后外泌体聚集;

l pH调节剂：维持冻干体系的pH稳定性;

赋形剂选择应遵循以下原则：

l 生物相容性：对细胞和组织无毒性或刺激性;

l溶解度：高溶解度便于与外泌体充分混合;

l粘度：适宜粘度，既不能过高导致复水困难，也不能过低影响保护效果;

l pH稳定性：能维持冻干体系的pH稳定性，防止活性成分降解;

l批次稳定性：确保不同批次间性能一致，CV值<15%;

2. 常用赋形剂及其特性

常用赋形剂及其特性如下表所示：

3. 赋形剂与保护剂的协同效应

赋形剂与保护剂的协同效应是提高冻干效果的关键：

l  海藻糖+甘露chun：两者复配可形成更均匀的冰晶分布，减少对膜结构的损伤。研究表明，比例1:2的海藻糖与甘露chun复配可使冻干外泌体存活率提升至90%以上。

l 海藻糖+泊洛沙姆：海藻糖提供结构保护，泊洛沙姆作为表面活性剂降低细胞膜微黏度，促进外泌体递送。研究证实，2%海藻糖组外泌体的分散程度更高，且不影响细胞摄取能力。

l 依克多因+Tris-HCl：依克多因提供膜结构保护，Tris-HCl维持pH稳定性，两者联用可使冻干外泌体在-80℃储存12个月后，颗粒浓度仅下降15%，且生物活性保留率达85%以上。

l 胆固chun+海藻糖：胆固chun增强外泌体膜的变形能力，海藻糖提供结构保护，两者联用可使外泌体与靶细胞膜的相互作用模式从内吞转变为融合，显著提高递送效率。

4. 赋形剂筛选实验设计

赋形剂筛选实验设计应包括：

4.1 物理稳定性评估：通过动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）评估冻干后外泌体的粒径分布、聚集率和形态完整性。

4.2 化学稳定性评估：通过SDS-PAGE和Western blot评估冻干后外泌体标志蛋白（CD9、CD63、CD81等）的表达水平；通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。

4.3 生物活性评估：通过细胞实验验证冻干后外泌体的功能活性，如抗炎、抗纤维化、促血管生成等；通过体内模型验证治疗效果。

4.4 复溶效率评估：测定复溶时间、复溶后浓度恢复率和分散性。

四、培养基开发：优化外泌体产生与稳定性的基础

1. 外泌体培养基的关键成分

外泌体培养基开发需考虑以下关键成分：

l 基础培养基：DMEM、RPMI-1640等，提供外泌体产生所需的基本营养物质

l血清替代物：胎牛血清（FBS）是传统来源，但存在批次差异大、成本高的问题，可考虑使用无血清培养基

l生长因子：EGF、bFGF等，促进细胞生长和外泌体分泌

l抗氧化剂：谷胱gan肽、维生suE等，保护外泌体活性成分

l pH调节剂：碳酸氢Na、HEPES等，维持培养液pH稳定

2. 培养基优化策略

培养基优化应关注以下方面：

l冻干耐受性优化：在培养基中添加特定成分（如胆固chun、抗氧化剂）以增强外泌体膜结构的冻干耐受性。研究表明，胆固chun添加至30%可显著增强外泌体膜融合效率及冻干后功能。

l批次稳定性控制：通过优化培养基成分和工艺参数，确保外泌体批次间差异小。研究显示，同一细胞系在不同培养规模（摇瓶vs.生物反应器）下产生的EVs在miRNA谱上存在超过400个差异表达基因，这直接导致产品质量的不确定性。

l细胞来源特异性：不同来源细胞产生的外泌体特性不同，培养基需针对性优化。例如，脐带间充质干细胞外泌体产量高，但不同代次的细胞分泌的外泌体活性不同，需确认最合适代次。

l规模化生产适配：从实验室规模到工业化生产的放大过程中，培养基需进行相应优化。3D培养技术、切向流过滤（TFF）系统、中空纤维生物反应器等新技术的发展为规模化生产提供了新思路。

3. 代表性培养基配方

基于现有研究，推荐以下培养基配方：

l 基础培养基：DMEM/F12（1:1）+10% FBS+1% Penicillin-Streptomycin+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate+1% Non-Essential Amino Acids

l无血清培养基：DMEM/F12（1:1）+10%胎牛血清替代物+5μg/mL EGF+10μg/mL bFGF+1% Penicillin-Streptomycin+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate+1% Non-Essential Amino Acids

l胆固chun增强培养基：DMEM/F12（1:1）+10% FBS+1% Penicillin-Streptomycin+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate+1% Non-Essential Amino Acids+30% Cholesterol

l抗氧化剂增强培养基：DMEM/F12（1:1）+10% FBS+1% Penicillin-Streptomycin+2mM L-Glutamine+1mM Sodium Pyruvate+1% Non-Essential Amino Acids+0.1-0.5%维生索C

4. 培养工艺优化

培养工艺优化对获得高质量外泌体至关重要：

l细胞密度控制：细胞密度通常为70-80%，过高或过低都会影响外泌体分泌量和质量

l培养时间优化：通常为48-72小时，时间太短产量低，时间太长可能导致细胞状态下降

l培养条件控制：温度（37℃）、CO₂浓度（5%）、湿度（95%）等需精确控制

l采收时机确定：通过定期检测上清液中的外泌体浓度和标志蛋白表达水平，确定采收时间

五、复溶溶液开发：确保冻干外泌体活性恢复的关键

1. 复溶溶液的功能与选择原则

复溶溶液在外泌体冻干制剂中承担以下关键功能：

l快速复溶：提供适宜的溶剂，使冻干外泌体快速恢复原始状态

l渗透压调节：避免复溶过程中因渗透压突变导致的膜结构破坏

lpH缓冲：维持复溶后体系的pH稳定性，防止活性成分降解

l功能活性恢复：确保复溶后外泌体的功能活性与冻干前相当

复溶溶液选择应遵循以下原则：

l生物相容性：对细胞和组织无毒性或刺激性

l渗透压匹配：与冻干保护剂残留浓度匹配，避免渗透压冲击

lpH稳定性：能维持复溶体系的pH稳定性，防止活性成分降解

l批次一致性：确保不同批次间复溶效果一致，CV值<15%

l操作简便性：复溶时间短，操作简便，适合临床应用

2. 复溶溶液配方设计

复溶溶液配方设计需考虑以下因素：

l 缓冲液类型：PBS、Tris-HCl、HEPES等，其中Tris-HCl缓冲液的pH稳定性（±0.2）优于其他缓冲液

l离子强度：Na⁺/K⁺浓度需与冻干保护剂残留浓度匹配，避免渗透压冲击

l 稳定剂：BSA、白蛋白等可提高复溶后外泌体的稳定性

l辅助成分：EDTA、抗坏血酸等可防止金属离子催化和氧化损伤

3. 复溶方法与参数优化

复溶方法与参数对冻干外泌体的活性恢复至关重要：

l复溶溶剂选择：推荐用PBS（pH 7.4），是冻干外泌体复溶的缓冲液，其离子强度（Na⁺/K⁺浓度）需与冻干保护剂的残留浓度匹配。

l 复溶温度控制：室温或37℃复溶，避免高温导致外泌体变性

l复溶时间优化：通常不超过5分钟，过长可能影响活性

l 复溶操作规范：缓慢沿管壁加入复溶溶液，轻轻旋转混匀，避免剧烈涡旋导致外泌体聚集

4. 复溶效果评价指标

复溶效果评价应包括以下指标：

l 复溶时间：≤5分钟

l复溶后浓度恢复率：R≥80%（R=(C_recon×V_recon)/(C_original×V_original)×100%）

l粒径分布变化：变化≤10%

l聚集率：<15%

l标志蛋白表达：CD9/CD63/CD81等阳性标志物保留率≥90%

l功能活性恢复：细胞摄取效率、靶向递送效率、治疗活性恢复率≥85%

六、洁净生产工艺开发：确保外泌体冻干制剂质量的关键

1. GMP洁净区设计与环境控制

外泌体冻干生产需符合GMP标准，洁净区设计与环境控制至关重要：

l洁净区等级：外泌体冻干生产需在B/C级背景下的生物安全柜或层流操作台进行

l 环境监测参数：粒子数（≤3520个/m³，ISO 5级）、微生物限度（沉降菌≤1CFU/15分钟）

l设备兼容性：生产设备需具备良好的洁净室兼容性，不得对环境造成污染

l人员操作规范：操作人员需严格遵循标准操作流程，降低人为误差和污染风险

l质量追溯系统：需对从原材料采购到产品生产、储存及使用的全流程进行数据记录

2. 外泌体提取与纯化工艺

外泌体提取与纯化工艺是冻干制剂质量的基础：

2.1 初步分离：

n低速离心（300×g，10min）去除完整细胞

n较高速度离心（2000×g，10min）去除死细胞碎片

n再次离心（10000×g，10min）去除大囊泡和凋亡小体

2.2 浓缩与纯化：

n 传统方法：超速离心（100000×g，2h）

n  现代方法：超滤、体积排阻色谱（SEC）、免疫亲和捕获等

n   硅化处理：使用硅化离心管减少外泌体吸附损失

2.3质量控制：

n形态检测：透射电镜（TEM）观察典型"茶托状"或杯状结构

n粒径分析：NTA检测粒径分布和浓度（如人脐带间充质干细胞外泌体典型粒径为146.7±4.9nm）

n标志蛋白检测：Western blot检测CD9、CD63、CD81等表达

n纯度与杂质控制：检测血清蛋白残留量（<50 ng/mL）、核酸酶残留，排除Calnexin等阴性标志物

n无菌性与内毒素：冻干前需通过0.22μm滤膜除菌，内毒素<0.5 EU/mL

3. 冻干工艺参数优化

冻干工艺参数优化是确保外泌体冻干后稳定性的关键：

l预冻阶段：温度-40℃至-50℃，时间12小时，确保冻结

l 一次干燥：温度-15℃至20℃，真空度0.05-0.2毫巴，升华时间24-48小时

l 二次干燥：温度30℃以下，真空度0.05毫巴，时间24-48小时，避免热敏感成分氧化

l 残余水分控制：通过水分测定仪控制残余水分含量在1%-3%，确保长期储存稳定性

l搁板温度梯度：根据产品厚度设置合理的搁板温度梯度，确保温度均匀性

4. 工艺验证与质量控制

工艺验证与质量控制是确保外泌体冻干制剂质量的保障：

l培养基模拟灌装验证：至少进行三批灌装验证，每瓶产品均需进行无菌检查，判断合格标准为无菌通过率100%

l除菌过滤系统适应性验证：包括过滤系统相容性测试、过滤前后滤膜完整性测试

l 冻干工艺验证：通过热穿透试验、微生物挑战试验（使用枯草芽孢杆菌孢子，验证SAL≤10⁻⁶）等验证冻干工艺稳定性

l关键质量属性（CQA）检测：包括标志蛋白表达、RNA完整性、无菌性、内毒素、活性保留率等

l批次间差异控制：通过优化工艺参数，将外泌体批次间差异（CV值）控制在15%以内

七、冻干制剂系统整合与验证

1. 系统整合验证策略

外泌体冻干制剂系统整合验证应采用多维度方法：

l 物理化学特性验证：通过NTA、TEM、DLS等技术监测冻干前后的粒径分布、颗粒浓度和形态完整性

l生物活性验证：通过细胞实验验证冻干前后的功能活性，如抗炎、抗纤维化、促血管生成等

l批次间差异控制：确保多批次冻干制剂的粒径（CV值<15%）、标志蛋白表达和功能活性一致

l稳定性预测模型构建：基于冻干工艺参数和保护剂/赋形剂组合，构建稳定性预测模型，指导工艺优化

2. 长期稳定性评估方案

长期稳定性评估方案应包括：

l 储存条件设计：25℃、4℃、-20℃、-80℃等不同温度条件

l 时间点设置：0、1、3、6、12、24个月定期取样

l检测项目：物理特性（粒径、浓度、聚集率）、化学特性（标志蛋白、RNA完整性）、生物活性（细胞摄取、靶向递送、治疗活性）

l加速试验：40℃/75%湿度条件下进行6个月加速试验，预测25℃下24个月稳定性

l 长期稳定性试验：25℃/60%湿度条件下进行12-24个月稳定性试验

3. 功能活性验证方法

功能活性验证是确保冻干外泌体治疗效果的关键：

l 体外功能实验：细胞增殖、凋亡、迁移、炎症因子分泌等

l体内模型验证：小鼠皮肤修复、伤口愈合、肿瘤抑制等

l临床前研究：遵循GLP规范，验证外泌体在动物模型中的治疗效果

l临床试验设计：根据适应症特点，设计相应的临床试验方案，验证冻干外泌体的临床疗效

4. 质量标准与监管要求

质量标准与监管要求是确保外泌体冻干制剂合规上市的保障：

l中国药典2025版要求：检测标志蛋白（CD9/CD63/CD81）、RNA完整性（RIN值≥7）、无菌性、内毒素（<0.5 EU/mL）及冻干后活性保留率（≥85%）

l  《外泌体冻干产品复溶活性等级划分与评价规范》：将复溶活性保留率与人体临床终点进行关联，划分为Ⅰ-Ⅳ级

l国际监管要求：遵循ICH Q8指导原则，采用"质量源于设计"（QbD）理念，通过系统理解产品与工艺的关联，在全生命周期中保障产品质量

l药械组合产品路径：2025年12月，国家医疗器械标准管理中心将"透明质酸钠外泌体膜液体fu料"界定为"药械组合产品"，为外泌体应用提供了新路径

八、结论与展望

外泌体冻干药物配方开发是一个系统工程，涉及保护剂、赋形剂、培养基、复溶溶液和洁净工艺的协同优化。通过科学筛选和优化保护剂与赋形剂组合，设计适合外泌体冻干的培养基与复溶溶液，建立符合GMP要求的洁净生产工艺，我们可以有效解决外泌体储存和运输中的难题，确保其在长期储存后的稳定性和生物活性。

未来，随着技术的不断发展和监管环境的不断完善，外泌体冻干药物配方开发将呈现以下趋势：

1. 个性化保护剂设计：根据外泌体来源和应用场景，设计个性化的保护剂配方

2.智能化冻干工艺：通过人工智能驱动的冻干工艺参数自主优化系统，提高冻干效率和产品质量

3. 多功能复溶系统：开发能够同时实现复溶和靶向递送的多功能复溶系统

4. 标准化质量控制：建立外泌体冻干制剂的标准化质量控制体系，确保产品质量的一致性

5.  临床转化加速：随着监管框架的完善，外泌体冻干制剂的临床转化将加速，为更多疾病治疗提供新选择