微生物冻干损伤耐受差异及冻干保护剂作用机制

一、不同微生物对冻干损伤的耐受差异

微生物对冻干损伤的耐受度核心取决于细胞结构完整性、含水量、休眠状态及生物大分子稳定性，细菌、真菌、病毒三类微生物的具体差异如下：

（一）细菌：芽孢菌＞营养体细胞，革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌

1.芽孢菌（如枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌）：耐受度高

(1)结构优势：芽孢壁和皮层致密，含肽聚糖与吡啶二羧酸（DPA），维持胞内低含水量（营养体的 10%~30%），减少冰晶形成；

(2)代谢休眠：完quan休眠状态，酶活性低，核酸和蛋白质结构稳定；

(3)损伤抵抗：冰晶机械损伤、脱水构象变化、氧化损伤均显著降低。

2.营养体细胞：耐受度中等偏低

(1)革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）：细胞壁厚（20~80nm），细胞膜胆固醇含量高，抗机械损伤和溶质损伤能力较强；

(2)革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）：细胞壁薄（2~3nm），细胞膜无胆固醇，脱水后脂质双分子层易相变，对冷冻和干燥损伤更敏感。

（二）真菌：孢子＞菌丝体，酵母菌＞霉菌营养体

1.真菌孢子（如青霉孢子、酵母菌子囊孢子）：耐受度较高

(1)结构特点：细胞壁含几丁质和葡聚糖，含水量低（20%~40%），自由水占比少；

(2)休眠特性：代谢微弱，酶和核酸稳定性高，抗氧化和吸潮 - 脱水循环损伤。

2.真菌营养体：耐受度中等

(1)酵母菌（如酿酒酵母）：细胞壁含葡聚糖和甘露聚糖，胞内天然海藻糖缓解损伤，含水量 70%~80%，耐受度高于革兰氏阴性菌营养体；

(2)霉菌菌丝体：丝状结构，细胞壁薄且连接松散，含水量高，易受冰晶挤压断裂和酶变性，耐受度zui低。

（三）病毒：无包膜病毒＞有包膜病毒，DNA 病毒＞RNA 病毒

病毒无完整细胞结构，耐受度依赖衣壳和包膜稳定性：

1.无包膜病毒（如腺病毒、脊髓灰质炎病毒）：耐受度较高

(1)结构优势：衣壳致密，保护核酸免受机械损伤、脱水构象变化及氧化损伤；

(2)核酸稳定性：双链 DNA 结构稳定，RNA 病毒衣壳可降低核酸降解风险。

2.有包膜病毒（如流感病毒、新冠病毒）：耐受度极低

(1)包膜脆弱性：脂质双分子层易受冷冻溶质破坏、干燥脱水失活及氧化损伤；

(2)核酸易降解：包膜破裂后，单链 RNA 直接暴露，易被自由基、氧气和光照降解。

三类微生物耐受度排序（由高到低）

芽孢菌＞真菌孢子＞无包膜病毒＞革兰氏阳性菌营养体＞酵母菌营养体＞革兰氏阴性菌营养体＞霉菌菌丝体＞有包膜病毒。

二、冻干保护剂的抗损伤机制

冻干保护剂通过针对性对抗冷冻损伤、干燥损伤及储存期损伤发挥作用，核心机制包括水替代、玻璃化形成、渗透压调节、氧化抑制等，具体类型及机制如下：

（一）糖类：常用核心保护剂（单糖、二糖、多糖）

1.核心机制

(1)水替代假说：糖类羟基（-OH）与生物大分子极性基团形成氢键，替代结合水，维持大分子构象稳定；

(2)玻璃化转变：形成无定形玻璃态结构，包裹大分子、减少冰晶形成、抑制分子运动，降低多阶段损伤。

2.不同糖类特点

(1)二糖（海藻糖、蔗糖）：保护剂效果好，羟基数量多，玻璃化温度高，适用于各类微生物；

(2)单糖（葡萄糖、果糖）：羟基少，玻璃化温度低，易结晶，常与二糖复配；

(3)多糖（葡聚糖、糊精）：分子量大，提高溶液黏度，减缓溶质扩散，形成细胞表面保护膜。

（二）蛋白质类保护剂（白蛋白、明胶、酪蛋白）

1.抗损伤机制

(1)缓冲与渗透压调节：缓冲 pH 变化，调节渗透压，减少胞内水分过度渗出；

(2)分子伴侣作用：维持酶和核酸天然构象，包裹细胞膜，减少机械损伤和脂质氧化；

(3)自由基清除：通过氨基酸残基捕获自由基，保护对氧化敏感的微生物。

（三）其他常见保护剂及协同作用

1.多元醇（甘油、甘露醇、山梨醇）

(1)机制：降低溶液冰点，减少冰晶形成；与生物大分子形成氢键，调节渗透压，缓解脱水收缩。

2.氨基酸（甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸）

(1)机制：作为相容性溶质维持渗透压平衡，清除自由基，抑制脂质过氧化。

3.复配保护剂的协同效应

(1)常用组合：糖类 + 蛋白质 + 多元醇（如海藻糖 + 白蛋白 + 甘油）；

(2)优势：覆盖冷冻、干燥、储存全阶段损伤，保护效果远优于单一保护剂。

总结

1.微生物冻干耐受度由结构特性（芽孢、包膜等）和生理状态（休眠 / 活跃）决定，芽孢菌和无包膜病毒耐受度高，有包膜病毒和霉菌菌丝体耐受度低；

2.冻干保护剂通过针对性阻断损伤路径（抑制冰晶形成、维持大分子结构、调节渗透压、清除自由基）提升微生物存活率，复配使用效果好