IVD试剂冻干制品开发服务

一、保护剂与赋形剂开发

1. 保护剂开发

保护剂是冻干过程中防止活性组分变性失活的关键成分，其选择和优化直接影响冻干制品的质量。IVD试剂冻干保护剂开发需遵循以下原则：

  n 针对性筛选：根据试剂类型（如核酸、酶类、抗原抗体）选择合适的保护剂。

l 实验方法：采用单因素筛选和正交试验相结合的方式，确定最佳保护剂种类和浓度。例如，通过活菌计数法评估保护效果，计算公式为：存活率(%)＝(冻干后活菌数/冻干前活菌数)×100%

l 协同优化：复合保护剂比单一成分效果更优。鸡重组α-干扰素冻干保护剂最佳配方为甘露醇(3%)+PEG(3%)，冻干粉剂在40℃条件下贮藏12个月，生物活性无变化

2. 赋形剂开发

赋形剂主要作用是支撑冻干制品的物理结构，使其具有良好的形态和机械强度，便于转移和储存  。

l 常用赋形剂：甘露醇、甘氨酸、乳糖、右旋糖苷等，其中甘露醇在核酸试剂中应用广泛，浓度通常在65%-68%(W/W)时可形成大小形态均一、吸湿性低的冻干微珠

l 筛选标准：需同时满足物理支撑（如冻干珠成型）和复溶效率要求，不影响复溶后的检测性能

l 协同开发：赋形剂与保护剂需协同优化。例如，重组猪抑制素蛋白冻干保护剂筛选中，可溶淀粉和β₂环糊精的保护效果较好，表现为外形饱满无坍缩、色泽细腻白亮、复溶后无沉淀、电泳检测发现蛋白条带无降解

二、冻干样品测试

冻干样品测试是评估冻干工艺效果的关键环节，主要包括以下方面：

1. 复溶效率测试

复溶效率直接关系到检测结果的准确性和操作便利性，测试指标包括：

l 复溶时间：记录冻干样品溶解所需时间，如羟基酪醇纳米脂质体冻干粉要求在1分钟内复溶成均匀悬浮液且无不溶颗粒或团块

l 复溶均匀性：通过目视观察或仪器检测样品溶解后的均匀程度

l 再分散性：评估冻干制品在复溶后的分散状态，如纳米颗粒是否保持良好分散性

2. 活性保留率测试

活性保留率是评价冻干制品质量的核心指标，测试方法因试剂类型而异：

l 核酸试剂：通过荧光定量PCR检测冻干前后核酸扩增效率，如CT值变化、荧光增益值等

l 酶类试剂：采用特定底物反应法测定冻干前后酶活性，如β-葡萄糖苷酶活性测定采用DNS法

l 抗原抗体试剂：通过ELISA等方法检测冻干前后抗体效价、特异性等指标的变化

3. 形态稳定性测试

形态稳定性影响冻干制品的物理性质和储存稳定性：

l 冻干显微镜观察：实时监测冻干过程中样品结构变化，评估塌陷温度

l 扫描电镜(SEM)分析：观察冻干制品微观结构，如冻干珠的表面形貌和孔隙结构

l 机械强度测试：评估冻干制品的抗压强度和脆碎度，如冻干珠需通过抗压测试确保在分装过程中不易碎裂

三、冻干曲线开发与关键温度测试

1. 冻干曲线开发

冻干曲线是冻干过程的关键指导文件，包含预冻、一次干燥（升华干燥）和二次干燥（解析干燥）三个阶段的温度-时间关系  。

l 预冻阶段：需根据共晶点确定温度（通常低于共晶点5-10℃），并控制降温速率（速冻或慢冻）。例如，5-氮杂胞苷-D-甘露醇溶液共晶点为-6.54℃，预冻温度选定为-25℃

l 一次干燥（升华干燥）：温度需低于共熔点（如-1.67℃），真空度控制在10-30 Pa，升温速率通常为2℃/min。如尿促性素一次升华温度为-12.5℃，维持70分钟

l 二次干燥（解析干燥）：需缓慢升温至更高温度（如20-40℃），确保残留水分去除。例如，硼替佐米二次升华阶段温度分别于5℃、20℃和40℃维持300分钟、110分钟和220分钟

2. 关键温度测试

冻干关键温度测试是确定冻干曲线的基础，主要包括以下参数：

l 共晶点测试：

n DSC热分析法：通过差示扫描量热仪测定，如5-氮杂胞苷-D-甘露醇溶液的共晶点为-6.54℃

n 电阻法：当物料冷冻温度降至某一值，物料全部冻结，电阻突然增大，该温度即为共晶点

l 共熔点测试：通过DSC测定，当温度升至某一值时冰晶开始熔化，该温度即为共熔点

l 玻璃化转变温度测试：通过DSC测定，如GGT试剂的玻璃化转变温度为-18.75℃

l 塌陷温度测试：

n 冻干显微镜法：实时观察冻干过程中样品结构变化，当干燥层温度上升到某一临界值时，固体基质的刚性不足以维持蜂窝状结构，空穴的固形物基质壁发生塌陷，该临界温度即为塌陷温度

n 介电分析法：通过介电性能的变化判定塌陷温度

四、生产放大方案设计

从小批量到大批量的生产放大是IVD试剂冻干制品开发服务的关键环节，需考虑以下因素：

1. 小批量生产（实验室级）

l 设备选择：0.1㎡冻干面积的冻干机，适用于小规模研发和验证

l 工艺验证：通过压力升测试、板温均匀性验证等方法确认冻干终点

l 样品测试：重点测试冻干制品的活性保留率、复溶效率和形态稳定性

2. 中批量生产（中试级）

l 设备升级：1㎡冻干面积的冻干机，适用于中等规模生产验证

l 工艺参数调整：根据放大效应调整冻干曲线，如注射用尿促性素的冻干工艺参数优化，将冻干周期由原来的22h缩短至18.5h

l 批次一致性验证：通过多批次测试确保产品质量稳定，如冻干珠的装量差异控制在±3%以内

3. 大批量生产（工业级）

l 设备选型：5㎡冻干面积的工业级冻干机，需满足GMP合规要求，如冷阱温度≤-60℃，极限真空度≥15 Pa，板温均匀性良好

l 工艺优化：采用数学模型（如冻干机热转移系数模型）指导工艺参数调整，减少放大实验次数

l 质量控制：建立全面的质量控制体系，包括原液质量控制、灌装过程控制、冻干过程监控和成品检测等

五、IVD试剂冻干制品开发服务实施路径

1. 项目启动与需求分析

l 与客户深入沟通，明确冻干制品的技术要求和质量标准

l 分析IVD试剂特性，确定保护剂和赋形剂开发方向

l 制定项目计划，明确各阶段时间节点和交付物

2. 保护剂与赋形剂开发

l 根据IVD试剂类型（核酸、酶类、抗原抗体）设计保护剂筛选方案

l 采用单因素筛选和正交试验确定最佳保护剂种类和浓度

l 通过响应面法优化复合保护剂配方，提高活性保留率

l 筛选合适的赋形剂，确保冻干制品良好的物理形态和机械强度

3. 冻干样品测试与关键温度测定

l 使用冻干显微镜（如LyoStat5）进行冻干前分析，确定塌陷温度、玻璃态转化温度等关键参数

l 通过DSC热分析仪测定共晶点、共熔点和玻璃化转变温度

l 制备冻干样品，进行活性保留率、复溶效率和形态稳定性测试

l 建立冻干制品的质量评价体系，制定质量标准

4. 冻干曲线开发与工艺优化

l 基于关键温度测试结果，设计初步冻干曲线

l 进行冻干实验，通过压力升测试、板温均匀性验证等方法确认冻干终点

l 优化冻干曲线，平衡冻干效率和产品质量

l 建立冻干过程监控体系，确保工艺参数稳定控制

5. 生产放大与规模转化

l 从小试（0.1㎡冻干面积）到中试（1㎡冻干面积）再到量产（5㎡冻干面积）的逐步放大

l 根据放大效应调整冻干曲线，确保不同批量产品质量一致

l 建立批次一致性验证方案，进行多批次测试

l 完成冻干制品的稳定性评估，包括实时稳定性、加速稳定性测试等

六、质量控制与合规性保障

1. 质量控制体系

l 建立完整的质量控制流程，包括原液质量控制、灌装过程控制、冻干过程监控和成品检测

l 制定关键质量属性(CQAs)清单，如活性保留率、复溶时间、水分含量等

l 建立关键工艺参数(CPPs)监控体系，如预冻温度、升华温度、真空度等

2. 合规性保障

l 确保冻干设备符合GMP要求，如内壁采用镜面抛光处理（粗糙度Ra≤0.8μm），配备在线CIP（原位清洗）和SIP（原位灭菌）功能

l 冻干过程参数需符合FDA 21 CFR Part 11数据合规要求，支持冻干过程参数实时监控、曲线存储与数据追溯

l 完成冻干制品的稳定性评估，包括实时稳定性（效期开始前、效期中、效期末）和加速稳定性测试

l 确保冻干制品符合目标市场法规要求，如欧盟IVDR、中国YY/T 1579-2017《体外诊断医疗器械体外诊断试剂稳定性评价》等

七、冻干制品稳定性评估与加速试验

1. 稳定性评估

l 实时稳定性：在预期储存条件下，定期检测冻干制品的关键质量属性，如活性保留率、复溶时间、水分含量等

l 加速稳定性：在较高温度（如40℃）和湿度条件下，快速评估冻干制品的稳定性

l 开瓶稳定性：评估冻干制品开封后的稳定性，如复溶稳定性、多次冻融稳定性等

l 运输稳定性：模拟实际运输条件（如温度波动、湿度变化、震动等），评估冻干制品的运输稳定性

2. 加速试验与长期试验关联性

l 通过加速试验快速筛选保护剂配方和冻干曲线，从中选出具有潜力的候选方案

l 采用稳定性方程预测冻干制品的储存周期，如某植物乳杆菌冻干样品的储存稳定性方程为：LgK=-8650/T+25.522

l 根据加速试验结果，设计长期稳定性试验方案，验证冻干制品的实际货架期